1.文章来源简介

这篇文章题目为“Extensiveinter-plantproteintransferbetweenCuscutaparasitesandtheirhostplants”。它是年12月5日在MOLECULARPLANT杂志上发表的。其中吴建强为论文的通讯作者，刘念为第一作者。这篇文章的研究首次证明了植物-植物间能进行大规模的蛋白质交流。由于菟丝子能够同时寄生不同科属的植物，因此同源蛋白以及某些科和属特异的蛋白能够跨科跨属直接转运，从而可能使受体植物获得崭新的性状。

2.研究背景及科学问题

旋花科菟丝子属的菟丝子植物是典型的全寄生植物，它的根和叶片退化，有的保留微弱的光合作用，有些则完全没有光合能力，必须依靠寄主才能存活。菟丝子将自己的茎缠绕在寄主的茎上，并产生吸器侵入到寄主的茎内，木质部与寄主的木质部相连，韧皮部与寄主的韧皮部相连，从而与寄主建立维管束的联系，通过这种维管束通道从寄主获得水分和营养等生长所需物质，同时一些大分子物质，例如病毒、植原体、RNA以及次生代谢产物也能通过这种维管束的连接，在寄主与菟丝子间进行交流，虽然已经确定了各种移动蛋白在植物内可转移，但菟丝子和寄主植物之间的蛋白质是否转移以及在多大程度上转移仍不清楚。这篇文章研究并报道了寄生植物菟丝子与寄主间大规模的蛋白质交流。研究发现，在菟丝子和寄主植物拟南芥和大豆之间转移了数百到多种蛋白质，甚至在菟丝子和寄主大豆的种子中检测到数百种植物间移动蛋白。通过菟丝子连接的不同宿主也发现可以交换数百种蛋白质。很可能多数转运蛋白质在经过长距离运输到达受体植物后仍保有其生物学功能，且可能对受体植物的生长发育及抗逆性产生影响。

3.主要实验方法

质粒构建与植株转化、植株培养及采样、蛋白提取和蛋白质组的分解、HPLC-MS、蛋白质组学的数据处理、转录组分析、蛋白印迹法、LUC活性测定、GUS染色和光镜检查、GUS活性测定、菟丝子茎的草铵膦耐受性试验、菟丝子种子对草甘膦的耐受性试验、RNA分离和RT-PCR等方法。

4.重要成果

（1）发现宿主和菟丝子茎之间存在蛋白质转移，确定主要转移蛋白种类，确定转移蛋白来源

为了研究菟丝子与寄主植物之间的蛋白质转移，他们用菟丝子(C.australis)侵袭拟南芥和大豆植物，当寄生关系建立好时，收集拟南芥茎、大豆茎和寄主茎近端和远端的两段菟丝子茎进行无标记肽定量蛋白质组分析。每组样品使用三个生物重复体，每组样品三个重复体中至少两个出现的肽被认为是阳性的。阳性鉴定的肽序列被映射到菟丝子和宿主（拟南芥或大豆)基因组，如果这两个基因组都不匹配(因为测序错误和翻译后修饰等）就过滤掉；与两个基因组相匹配且仅与天然基因组相匹配的肽被认为来自天然蛋白质；而仅与外源植物基因组相匹配但不与天然植物基因组相匹配的肽被认为是移动蛋白。在菟丝子近端和远端茎段中，分别鉴定了和个拟南芥蛋白和和个大豆蛋白，占各自寄主茎中鉴定的拟南芥和大豆蛋白物种总数的27.0%（/)和37.9%(/）(图1A、1B和补充数据1)。此外，在拟南芥和大豆茎中分别检测到和种菟丝子蛋白，这些蛋白分别占菟丝子茎中总菟丝子蛋白种类的17.4%（/)和28.3%(/）(图1A、1B和补充数据1)。虽然宿主植物产生的蛋白质主要分布在菟丝子近端和远端茎段，但一些蛋白质仅在这两个菟丝子茎段中的一个或另一个中检测到(图1C)。他们推测，在近端部位特异性检测到的蛋白质可能具有较高的周转率，使其在远端节段未被检测到；相反，一些快速转运的宿主蛋白可能在菟丝子远端节段积累，而在近端部分未被检测到。

转录因子(TFs)通常具有较低的蛋白质丰度，因此在蛋白质组分析中很难检测到，研究发现6个拟南芥和8个大豆TFs从宿主转移到菟丝子（补充表1），然后分别将4个和9个菟丝子TFs转移到拟南芥和大豆中（补充表1）。除了TFs外，一些潜在的病原体(如R蛋白)和抗虫蛋白(如Ps)被转运到外来植物中，并可能产生对生物胁迫的抗性（补充表2）。两个R蛋白和一个P分别从拟南芥和大豆转移到菟丝子茎，然后一个R蛋白和一个P分别被转运到拟南芥和大豆。在黄瓜和西瓜韧皮部汁液样品中已经鉴定出多种蛋白质[1]。因此，结合他们的植物间移动蛋白和在葫芦科发现的蛋白，他们接下来研究哪些移动蛋白是特定的，哪些在不同的植物家族中是常见的。利用正交和Venn图分析，发现54个蛋白质物种在远距离转移中可能是保守的(图1D)，基因本体(GO)分析表明，这54个保守的蛋白质物种主要与外轴模式规范、细胞壁果胶代谢过程、糖异生、对葡萄糖的反应、肌动蛋白丝束组装和海藻糖代谢（补充数据2）有关。个菟丝子蛋白被发现是特定的菟丝子产生的移动蛋白(图1D)，它们被转移到拟南芥和大豆，这意味着一些菟丝子特异性蛋白可能对菟丝子寄生很重要。GO分析表明，这种菟丝子蛋白在GTP生物合成过程、UTP生物合成过程、核苷二磷酸磷酸化、三羧酸循环和CTP生物合成过程中富集（补充数据2）。

此前，有研究表明，数千mRNA是在菟丝子和宿主之间转运的[2]。为了比较植物间蛋白和mRNA的转移，对拟南芥-菟丝子和大豆-菟丝子系统中相同组织的转录体进行了测序，以获得植物间移动mRNA，但在对样品进行测序之前（每组三个生物重复），因为在菟丝子近端和远端茎段中发现的移动宿主蛋白几乎没有差异，RNA-seq被认为比蛋白质组学分析更精确地检测外源mRNA。在拟南芥-菟丝子系统中，只有0.06%和0.28%的读取分别来自菟丝子和拟南芥转录体中的外源植物(补充图1A和补充数据3，百分比是仅映射到外国基因组的读取数与映射到外国和本国基因组的总读数)；对外国和本国mRNA计数数(CNS)分布的分析也表明，单个移动mRNA的丰度远低于本地的读取数(补充图1A)。相反，在拟南芥茎中，菟丝子蛋白的质谱(MS)总前体强度(TPIs)与所有蛋白质的比值为16.68%。在菟丝子茎（包括近端和远端节段）中，菟丝子茎蛋白TPI的4.30~4.53%由拟南芥移动蛋白贡献(图1E)。一般来说，大多数外源蛋白的估计相对蛋白质丰度(ERPA)低于天然蛋白，但与外源mRNA的相对丰度相比，其ERPA中的单个移动蛋白要大得多(图1E和补充图1A)。同样，在大豆-菟丝子系统中，菟丝子转录组含有1.22%的大豆读取器，大豆转录组只含有0.19%的菟丝子读取器(补充图1A和补充数据3)；然而，大豆蛋白质组中13.70%的TPI和10.95-11.17%的TPI分别来自菟丝子和大豆蛋白(图1E)。易位蛋白的相对丰度通常远高于mRNA(图1E和补充图1A)。此外，在菟丝子茎中发现的个拟南芥蛋白和个拟南芥mRNA中，只有14个是共同转移的(补充图1B)。对拟南芥茎中鉴定的个菟丝子蛋白和个菟丝子mRNA的比较表明，个菟丝子位点的转录本和蛋白质是共同转移的(补充图1B)。在大豆-菟丝子系统中，他们发现没有大豆mRNA和蛋白质被共同转移到菟丝子茎中，在从菟丝子转移到大豆茎的所有蛋白质（）和mRNA（）中，个菟丝子位点的转录本和蛋白质被共同转移(补充图1C)。这些数据表明，这些物种间的移动蛋白大多是易位的蛋白质，但不是从国外植物中的移动mRNA合成的新蛋白质。

（2）植物间转移报告蛋白能保持其活性

为了进一步评估植物间蛋白的转运，并研究植物间移动蛋白在长距离转移后是否保持其活性，培育出表达5种报告蛋白的拟南芥植株，即GFP(增强GFP)-GUS（β-葡萄糖醛酸酶）融合蛋白(90kDa)、GUS(68kDa)、LUC（荧光素酶）(60kDa)、eGFP(27kDa)和PAT(磷酸酶乙酰转移酶22kDa)（补充表3），并对这些植株进行了侵染。在表达eGFP-GUS或GUS的拟南芥植物上生长的菟丝子的茎中明确地检测到GUS活性(图2A至C和补充图2A)。eGFP-GUS蛋白专门位于菟丝子的筛细胞中(图2A)，表明它是通过韧皮部转运的。在菟丝子茎的近端和远端检测到LUC活性，其宿主表达LUC(图2D和补充图2B)。使用Westernblotting，在表达eGFP的拟南芥上生长时，近端和远端菟丝子片段中清楚地检测到eGFP(图2E)，可能是由于菟丝子的自荧光和转移的eGFP水平相对较低，eGFP荧光在视觉上未被检测到。此外，与在抗glufosate大豆上生长的菟丝子中发现的结果一致(Jiang等人，年)，与PAT基因(编码22kDa蛋白的)转化的拟南芥植物的菟丝子寄生变得对glufosate具有耐受性(补充图2C)。根据他们的蛋白质组学数据，在菟丝子和大豆宿主之间转移了茉莉酸(JA)生物合成酶AOS（烯氧化物合成酶)(补充数据1）。为了进一步证实AOS的运动，拟南芥与FLAG标记(58kDA)融合在拟南芥中，在其天然启动子的控制下表达。在表达AOS-FLAG的拟南芥上生长时，菟丝子茎中明显检测到AOS-FLAG，而WT拟南芥上的菟丝子茎没有可检测到的信号(图2F)。他们还检查了这六个转基因的转录本是否可以用PCR检测到菟丝子，但没有获得PCR产物(补充图2D)。因此，eGFP-GUS、GUS、LUC、eGFP、PAT和AOS蛋白从拟南芥转移到菟丝子茎中，而不是从流动拟南芥mRNA中翻译出来。这些流动的eGFP-GUS、GUS、LUC和PAT在外源植物中保留了它们的活性，尽管eGFP和AOS的低水平和复杂的AOS生化分析程序，没有检测到eGFP和AOS的活性。

（3）蛋白质可以在大豆和菟丝子种子间转运

接下来，他们开始研究是否可以将种间移动蛋白转移到种子中，他们已经发现了茎中大量的蛋白质转运。在大豆植物上寄生菟丝子，直到两者都产生种子，并对种子进行蛋白质组分析（每组样品使用三个生物重复；菟丝子在拟南芥上寄生时不产生种子，因此拟南芥-菟丝子系统被排除在这一分析之外）。在菟丝子和大豆种子中，他们分别鉴定了和个蛋白质。其中，个大豆蛋白和个菟丝子蛋白分别被送到菟丝子和大豆种子中(图3A和补充数据1)。这些易位蛋白的TPI分别为菟丝子和大豆种子蛋白质组的8.84%和2.23%；外源蛋白和天然蛋白的ERPA分布表明，种子中单个外源蛋白的丰度总体上仅略低于天然蛋白(图3B)。虽然从大豆到菟丝子的蛋白质几乎没有富集GO（补充表4），但对进入大豆种子的菟丝子蛋白的GO分析表明，富集的GO主要与初级代谢有关，包括糖酵解过程、三羧酸循环和糖异生，GO氧化还原过程和热应答（补充表4）。

同样的样品用于RNA-seq分析，以研究是否有mRNA转移到宿主和菟丝子的种子。在种子中聚集外源mRNA：在菟丝子和大豆种子中分别鉴定了个大豆mRNA和91个菟丝子mRNA（补充数据3）。从大豆中读取的数据估计为菟丝子中可映射读取总数的0.41%，从大豆种子中读取的数据1.37%来自菟丝子，与天然mRNA相比，大多数外源mRNA具有很低的CNS(图3B)。从大豆到菟丝子的个蛋白质和mRNA的同源性比较表明，只有个大豆位点的转录本和蛋白质被共转移(图3C)。在来自菟丝子的个蛋白质和91mRNA中，只有17个菟丝子mRNA和相应的蛋白质从菟丝子共转移到大豆种子(图3C)。与茎中发现的相似，在菟丝子和大豆种子中分别发现了3种大豆和3种菟丝子TFs（补充表1）。将两种大豆和一种菟丝子P转运到外源植物种子中（补充表2）。

他们接下来打算证明蛋白质从外源植物转移到菟丝子或宿主种子是否能保持其活性，是否会影响种子生理。在表达GUS或EPSPS的转基因大豆系（5-烯醇丙酮-石马酸-3-磷酸合成酶，一种除草剂草甘膦抗性蛋白）和WT大豆上的菟丝子上感染菟丝子作为比较。高GUS活性，可通过GUS染色检测，当菟丝子花生长在表达GUS的大豆上时，在菟丝子花中)。菟丝子种子中的GUS活性仅用荧光定量法检测，但在表达GUS的转基因大豆上收获的菟丝子种子中的GUS活性大于WT大豆上菟丝子种子中的GUS活性(图3E)。在表达EPSPS的大豆植株上生长的菟丝子种子在草甘膦处理或水（作为对照条件）下萌发。在对照和草甘膦处理条件下，从EPSPS表达的大豆中收集的菟丝子种子的发芽率相同，但在草甘膦处理下，从菟丝子上收集的种子在对照条件下的发芽率下降了30%(图3F)。

5.对研究领域的贡献

该研究对了解植物间相互作用的分子机制有较重要意义，也为植物体内物质（包括信号）的长距离运输的研究提供了新视角和新方法。首次证明了植物-植物间能进行大规模的蛋白质交流。

6.存在的问题及分析

不同寄主间超过七百个蛋白质能通过菟丝子“通道”进行长距离运输。菟丝子与寄主之间交流的蛋白质也可以逐步提取检测。通过利用质谱信号估算，至少11.5%的蛋白质在到达受体植物后还能保持至少50%的蛋白量，长距离运输后的蛋白活性可能会随检测技术的进步而更精确。

参考文献

[1]Hu,C.Y.,Ham,B.K.,El-Shabrawi,H.M.,Alexander,D.,Zhang,D.B.,Ryals,J.,andLucas,W.J.().

[2]Kim,G.,LeBlanc,M.L.,Wafula,E.K.,Depamphilis,C.W.,andWestwood,J.H.().Genomic-scaleexchangeofmRNAbetweenaparasiticplantanditshosts.Science:-.